Оценка фрагментации ДНК спермы: действительно ли это полезно?

THE EDITORIAL

by Basil C. Tarlatzis, Professor of Obstetrics — Gynecology and Human Reproduction
First Department of Obstetrics and Gynecology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece
and Dimitrios G. Goulis, Assistant Professor of Reproductive Endocrinology
First Department of Obstetrics and Gynecology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece

Оценка фрагментации ДНК спермы: действительно ли это полезно?
Sperm DNA fragmentation assessment: Is it really helpful?

Проф. Basil C. Tarlatzis и асс.проф.Dimitrios G. Goulis, Салоники, Греция
Для фертилизации, как естественной, так и с использованием вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) сперма имеет двоякое значение, поскольку она несет информацию и включает клетки — носители этой информации. В эру Intra-Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) необходимой является только информация, включающая гаплоидный геном, центросому, нужные для деления клетки и важные факторы для развития плаценты. Спермальная ДНК несет в себе половину генетического материала потомства и нарушенная ДНК, например, в случае ее фрагментации, когда наблюдаются избыточные разрывы нитей, может приводить к расстройству репродуктивного процесса. Представляется правдоподобным, что разрывы нитей спермальной ДНК могут оказывать влияние на фертилизацию и рождение здорового ребенка. У млекопитающих спермальный хроматин отличается от такового соматических клеток по своей структуре и композиции. Фактически спермальный хроматин характеризуется наиболее компактной структурой среди всех эукариотических клеток. Эта компактная структура важна для защиты генетической целостности во время транспорта отцовского генома через мужской и женский репродуктивные тракты. Фрагментация ДНК может характеризоваться как разрывом одной, так и двух ее нитей. В ходе сперматогенеза развивающиеся сперматозоиды постепенно теряют способность восстанавливать возможные повреждения ДНК. Таким образом, поломки ДНК в течение или после ее упаковки могут миновать корректирующие этот процесс механизмы и попасть в развивающуюся сперму. Точные механизмы, приводящие к ДНК фрагментации пока не известны. Предлагаемые теории включают дефекты во время упаковки спермального хроматина, незавершенный апоптоз и оксидативный стресс. Очевидно, что механизмы, которые приводят к фрагментации ДНК взаимосвязаны, поскольку упаковка патологического хроматина ведет к дефективному протаминированию, что делает сперму более чувствительной к неблагоприятным воздействиям, например, к влиянию высокореактивных молекул кислорода. Некоторые внешние условия и факторы связаны с повышением процента сперматозоидов с нарушенной ДНК в эякуляте, хотя механизмы, лежащие в основе этих нарушений, также не известны. Среди этих воздействий наиболее важными являются курение, инфекции полового тракта, рак яичек и болезнь Ходжкина, ятрогенное повреждение, например, при подготовке спермы во время протокола ВРТ, а также гипертермия, воздействие пестицидов и загрязнение окружающей среды. Методы для диагностики фрагментации ДНК спермы подразделяются на прямые и непрямые. С помощью прямых методов выявляются уже имеющиеся поломки ДНК, в то время как непрямые методы позволяют оценить подверженность спермальной ДНК поломкам после внешнего неблагоприятного воздействия, например, добавления кислоты. Наиболее широко применяемые прямые методы включают: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Nick End Labeling (TUNEL), Single Cell Gel Electrophoresis (COMET) and In-Situ Nick Translation (NT) assay. К наиболее известным непрямым методам относятся: Flow flow cytometric acridine orange assay, Acridine Orange test (AO), DNA Break Detection-Fluorescence In Situ Hybridization (DBD-FISH) и Sperm Chromatin Dispertion test (SCD). Несмотря на различные методы оценки нарушений, все они направлены на то, чтобы попытаться определить общее число фрагментаций ДНК в независимости от участка генома, где это нарушение имело место. При этом, поломки одних генов являются крайне нежелательными, а другие могут происходить в «спящих» областях генома, но пока эти вопросы остаются не изученными. К настоящему времени отсутствует дифференциация между клинически значимой и незначимой фрагментацией. Недавно проведенный мета-анализ выявил статистически значимое отношение шансов (ОШ), составившее 6.54 [(95% доверительный интервал (ДИ) 1.71, — 24.91]) и 7.58 (95% ДИ; 2.54, — 22.67), когда пары с величиной Индекса ДНК Фрагментации < 30% и < 40%, соответственно, сравнивались с парами с более высокими показателями этого индекса. Во многих исследованиях с применением различных методик продемонстрировано статистически значимые отличия фрагментации ДНК спермы между фертильными и нефертильными мужчинами. Выявлен большой разрыв между значениями показателей, полученных у фертильных и нефертильных мужчин. Пока не получены референтные значения для четкого разделения этих двух групп, которые могли бы быть приняты вне всякого сомнения. Важно отметить, что показатели, полученные при использование различных методик не могут сравниваться. Представляется также неправомочным сравнивать значения, полученные в разных лабораториях, даже при использовании одинаковых технологий, так как многие лабораторные факторы и различия в протоколах могут значительно повлиять на результаты. Технологии IVF и ICSI представляют значительные терапевтические возможности, даже в случае тяжелого мужского бесплодия. До сих пор обычно используемые параметры спермы не могли служить предикторами результатов IVF; в последние годы фрагментация спермальной ДНК представляется альтернативным фактором, который может помочь предсказать эти результаты. Множество исследований различного качества проводилось с целью изучения взаимосвязи между фрагментацией спермальной ДНК и уровнем наступления беременности в ходе стандартной IVF и ICSI, однако получены противоречивые результаты. В недавно проведенном мета-анализе тринадцати работ фрагментация спермальной ДНК статистически значимо, хотя и слабо, коррелировала с уровнем наступления беременности (OР = 1.44, 95% ДИ; 1.03 — 2.03). Эта слабая взаимосвязь не может считаться клинически значимой или доказательной, чтобы разделять по этому показателю пары, у которых беременность наступила или у которых ее не удалось достичь. Таким образом, пока отсутствуют достаточно убедительные данные, чтобы проводить рутинное определение фрагментации ДНК в качестве прогностического фактора наступления беременности после процедур IVF или ICSI. В заключение следует отметить, что фрагментация ДНК является новым параметром оценки мужского фактора бесплодия и возможным предиктором результатов ВРТ. Хотя эти исследования представляется многообещающими, остаются сомнения в отношении практической полезности оценки этого параметра в качестве фактора, играющего роль предиктора при проведении диагностики бесплодия, а также в отношении того, что в действительности при этом измеряется. Значительное отличие протоколов в отдельных лабораториях во всем мире, отсутствие референтных значений и достоверного подтверждения его актуальной значимости в качестве независимого или дополнительного фактора мужского бесплодия пока служит препятствием для его утверждения в качестве рутинного диагностического теста у бесплодных мужчин. 

Вопросы-ответы.

1. Что такое фрагментация ДНК?
Фрагментация ДНК характеризуется разрывом одной или двух нитей ДНК. В ходе сперматогенеза развивающиеся сперматозоиды постепенно теряют способность восстанавливать возможные повреждения ДНК. Таким образом, поломки ДНК в течение или после ее упаковки могут миновать корректирующие этот процесс механизмы и попасть в развивающуюся сперму.

2. Какие механизмы приводят к ДНК фрагментации?
Точные механизмы, которые приводят к разрыву нити ДНК, остаются пока не ясными. Предложены три теории:
1.Нарушение упаковки спермального хроматина
2.Незавершенный апоптоз
3.Оксидативный стресс

3. Какие факторы и заболевания коррелируют с фрагментацией ДНК?
Некоторые внешние условия и факторы связаны с повышением процента сперматозоидов с нарушенной ДНК в эякуляте, хотя точные механизмы лежащие в ее основе не известны. Среди них наиболее важными являются:
1.Курение
2.Инфекции полового тракта
3.Рак яичек и болезнь Ходжкина
4.Ятрогенные нарушения, например, при подготовке спермы в протоколах ВРТ
5.Гипертермия, воздействие пестицидов и загрязнение окружающей среды

4. Каковы методы выявления фрагментации спермальной ДНК?
Методы для диагностики фрагментации ДНК спермы подразделяются на прямые и непрямые. С помощью прямых методов выявляются уже имеющиеся поломки ДНК, в то время как непрямые методы позволяют оценить подверженность спермальной ДНК поломкам после внешнего неблагоприятного воздействия, например, добавлению кислоты. Наиболее широко применяемые прямые методы включают: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Nick End Labeling (TUNEL), Single Cell Gel Electrophoresis (COMET) and In-Situ Nick Translation (NT) assay. К наиболее известным непрямым методам относятся: Flow flow cytometric acridine orange assay, Acridine Orange test (AO), DNA Break Detection-Fluorescence In Situ Hybridization (DBD-FISH) and Sperm Chromatin Dispertion test (SCD).

© International Society of Gynecological Endocrinology — n. 34/June 2009